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人膜攻擊復(fù)合物(MAC)ELISA試劑盒說明書
更新時(shí)間:2015-08-28 點(diǎn)擊量:689

人膜攻擊復(fù)合物(MAC)酶聯(lián)免疫分析(ELISA

試劑盒使用說明書

本試劑僅供研究使用

目的:本試劑盒用于測(cè)定人血清,血漿及相關(guān)

液體樣本中膜攻擊復(fù)合物(MAC)的含量。

實(shí)驗(yàn)原理:

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中人膜攻擊復(fù)合物( MAC)水平。用純化的人

膜攻擊復(fù)合物(MAC)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入膜

攻擊復(fù)合物(MAC),再與 HRP標(biāo)記的羊抗人抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,

經(jīng)過*洗滌后加底物 TMB顯色。TMB在  HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下

轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的膜攻擊復(fù)合物( MAC)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在

450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值),通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人膜攻擊復(fù)合物(MAC)含

量。

試劑盒組成:

試劑盒組成

說明書

48孔配置

1

96孔配置

1

保存

封板膜

2片(48

1個(gè)

2片(96

1個(gè)

密封袋

酶標(biāo)包被板

標(biāo)準(zhǔn)品:135pg/mL

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

酶標(biāo)試劑

1×48

1×96

2-8℃保存

2-8℃保存

2-8℃保存

2-8℃保存

2-8℃保存

2-8℃保存

2-8℃保存

2-8℃保存

2-8℃保存

0.5ml×1

1.5ml×1

3 ml×1

3 ml×1

3 ml×1

3 ml×1

3ml×1

20ml×20倍)×1

0.5ml×1

1.5ml×1

6 ml×1

6 ml×1

6 ml×1

6 ml×1

6ml×1

20ml×30倍)×1

樣品稀釋液

顯色劑 A

顯色劑 B

終止液

濃縮洗滌液

樣本處理及要求:

1.血清:室溫血液自然凝固  10-20分鐘,離心  20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上

清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心。

2.血漿:應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇   EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合  10-20分鐘后,離心

20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)該再次

離心。

3.尿液:用無菌管收集,離心   20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程

中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。

1

 



4.細(xì)胞培養(yǎng)上清:檢測(cè)分泌性的成份時(shí),用無菌管收集。離心  20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/

分)。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí),用 PBSPH7.2-7.4)稀釋細(xì)胞懸液,細(xì)胞

濃度達(dá)到 100/ml左右。通過反復(fù)凍融,以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心  20

鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。

5.組織標(biāo)本:切割標(biāo)本后,稱取重量。加入一定量的  PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)?/span>

用。標(biāo)本融化后仍然保持 2-8℃的溫度。加入一定量的  PBSPH7.4),用手工或勻漿器

將標(biāo)本勻漿充分。離心 20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待

檢測(cè),其余冷凍備用。

6.標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上

進(jìn)行試驗(yàn),可將標(biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

7.不能檢測(cè)含NaN3的樣品,因    NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

操作步驟

1.

標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣:在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔 10孔,在*、第二孔中分別加標(biāo)

準(zhǔn)品 100μl,然后在*、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μl,混勻;然后從*孔、第二

孔中各取 100μl分別加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μl,

混勻;然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl棄掉,再各取  50μl分別加到第五、第六孔

中,再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50ul,混勻;混勻后從第五、第六孔中各

取 50μl分別加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液  50μl,混

勻后從第七、第八孔中分別取 50μl加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)

品稀釋液 50μl,混勻后從第九第十孔中各取 50μl棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為 50μl,

濃度分別為 90 pg/mL60 pg/mL,30  pg/mL,15 pg/mL,7.5 pg/mL)。

加樣:分別設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同)、待測(cè)樣

品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl,然后再加待測(cè)樣品 10μl(樣

品zui終稀釋度為 5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混

勻。

2.

3.

4.

5.

溫育:用封板膜封板后置 37℃溫育30分鐘。

配液:將 3048T的  20倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水 3048T的  20倍)倍稀釋后備用。

洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置 30秒后棄去,如此

重復(fù) 5次,拍干。

6.

7.

8.

9.

加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑 50μl,空白孔除外。

溫育:操作同 3。

洗滌:操作同 5。

顯色:每孔先加入顯色劑 A50μl,再加入顯色劑 B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色

15分鐘.

10.終止:每孔加終止液   50μl,終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。

11.測(cè)定:以空白空調(diào)零,450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD 值)。測(cè)定應(yīng)在加終止

液后 15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

注意事項(xiàng):

1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡  15-30分鐘后方可使用,酶標(biāo)包被板開封后如未

用完,板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

2.濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出,稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,洗滌時(shí)不影響結(jié)果。

3.各步加樣均應(yīng)使用加樣器,并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性,以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間

控制在 5分鐘內(nèi),如標(biāo)本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣。

4.請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高(樣本  OD

2




大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的 OD值),請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)(n倍)后再測(cè)定,計(jì)

算時(shí)請(qǐng)zui后乘以總稀釋倍數(shù)(×n×5)。

5.封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。

6.底物請(qǐng)避光保存。

7.嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行,試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).

8.所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

9.本試劑不同批號(hào)組分不得混用。

10.如與英文說明書有異,以英文說明書為準(zhǔn)。

計(jì)算:

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),

在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品的  OD

值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度;再乘以稀釋

倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD值計(jì)算出標(biāo)

準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,將樣品的 OD

代入方程式,計(jì)算出樣品濃度,再乘以稀釋

倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度。

(此圖僅供參考)

試劑盒性能:

1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù) R值為  0.95以上。

2.批內(nèi)與批間應(yīng)分別小于 9%和  11%

檢測(cè)范圍:

3 pg/mL -120 pg/mL

保存條件及有效期:

1.試劑盒保存:;2-8℃。

2.有效期:6個(gè)月

3

 

滬公網(wǎng)安備 31011802001677號(hào)

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