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安培酶聯(lián)免疫分析法

安培法是酶聯(lián)免疫分析中另一種常用的電化學(xué)分析技術(shù)。它是將工作電極的電為控制在被測定物質(zhì)能發(fā)生氧化/還原反應(yīng)的某個確定電位上，當(dāng)樣品中含有該物質(zhì)時，就會產(chǎn)生可以檢測的電流，通過電流的大小就可以對該物質(zhì)的濃度進行測定。由于該方法常應(yīng)用在色譜和流動體系的電化學(xué)檢測器上，所以又稱為控制電位安培檢測。當(dāng)色譜和流動體系中分離流出的化合物經(jīng)過該檢測器時，可根據(jù)所產(chǎn)生的電流來判斷吧被測物質(zhì)流出的時間，根據(jù)電流峰的大小來判斷化合物的濃度。由于電化學(xué)檢測器的靈敏度高、死體積小，所以在色譜和流動分析中應(yīng)用廣泛。只要具有性的物質(zhì)都可以進行測定，如苯酚類、硫醇類、硝基化合物、亞胺類、醌類、吩噻嗪類有機物，可以根據(jù)所測定的化合物的電化學(xué)性質(zhì)選擇相應(yīng)的測定電位。

安培法中zui簡單、zui常用的模式是在恒定的電位下測定待測物質(zhì)的氧化還原電流，這種恒電位測量模式可以避免雙電層充電和表面瞬變效應(yīng)，因而信噪比高，可以達到很低的測定下限，還可以根據(jù)需要改變電位的各種參數(shù)，采用不同的電位脈沖檢測模式如示差脈沖安培法、反向脈沖安培法、三脈沖安培法，或是采用雙電極或多電極檢測模式，以達到檢測低濃度樣品的要求。

    安培酶聯(lián)免疫分析常用的酶-底物體系

由于安培法可以檢測有電化學(xué)活性的有機物，如苯酚類，所以理論上只要酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物含有有些電活性基因，均可用安培法進行測定。在酶免疫分析中應(yīng)用較多的是堿性磷酸酶，其酶催化水解產(chǎn)物為相應(yīng)的醇或酚，可以用安培法進行檢測，特別是電化學(xué)氧化對其測定的報道較多，采用的工作電極有碳電極、金屬電極、化學(xué)修飾電極等。美國Cincinati大學(xué)的 Heine-man等人在這方面做了大量工作，他們采用不同的免疫分析模式，結(jié)合不同的工作電極，以及各種電化學(xué)測定技術(shù)，測定了多種臨床樣品和藥物。他們zui早用AP電化學(xué)酶免疫分析的底物是磷酸苯酯，在酶的催化作用下發(fā)生水解反應(yīng)生成苯酚，可在電極上氧化而產(chǎn)生氧化電流，氧化電流的大小同酶的濃度有關(guān)系，進而可用于酶免疫分析。但是由于苯酚的電化學(xué)氧化過程為不可逆過程，測定時苯酚電氧化產(chǎn)物會吸附在電極表面而污染電極，導(dǎo)致測定靈敏度下降，同時氧化電位太高而造成檢測時背景電流較大，所以采用其他底物的報道日益增多。已被研究的底物有對氨基磷酸苯酯、對甲氧基磷酸苯酯、a萘酚磷酸苯酯等，其酶催化水解產(chǎn)物均為酚類物質(zhì)，可以用安培法測定其氧化電流的大小進而測定其酶的活力。

   液相色譜安培酶聯(lián)免疫分析

液相色譜（HPLC）具有非常的分離效率，是一種選擇性好、靈敏度高的分離分析方法。HPLC的檢測器有紫外吸收檢測器、示差折光檢測器、電化學(xué)檢測器等。由于電化學(xué)檢測器具有死體積小、響應(yīng)速度且具有線性響應(yīng)關(guān)系好、價格便宜等優(yōu)點，所以近十幾年來在HPLC方面的發(fā)展十分迅速。酶催化反應(yīng)后的溶液通常是混合組分，將其與HPLC聯(lián)用后利用色譜加以分離并除去相應(yīng)干擾物，可以有效地提高待測物質(zhì)的測定靈敏度。在液相色譜安培酶免疫分析操作中應(yīng)注意以下幾個問題。

    流動相和樣品

 在HPLC中流動相的選擇非常重要，一方面它起載體作用，將酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物同樣品中的其他物質(zhì)如未反應(yīng)的底物、蛋白質(zhì)等進行分離：另一方面它還要作為電化學(xué)檢測的支持電解質(zhì)起導(dǎo)電作用，所以一般選擇用導(dǎo)電性溶液作為流動相。一般反相色譜的流動相具有有極性，可用于電化學(xué)檢測器，而正相色譜可以通過加電解液后柱、采用大體積的壁噴式檢測器等方法來改善電化學(xué)檢測器的適應(yīng)性。另外在待測物質(zhì)的氧化還原反應(yīng)中常常會消耗或產(chǎn)生質(zhì)子，因此在實驗中控制流動相的pH也是十分重要的。一般來說緩沖液的濃度在0.01~0.1mol/L，其組成和pH的選擇要根據(jù)待測物質(zhì)的實際情況加以確定。溶劑和電解質(zhì)的純度越高，背景和噪聲電流越低。

生物樣品中常會含有蛋白質(zhì)等大分子，在酶免疫分析過程中也可能因為抗原抗體復(fù)合物的解離而使樣品中存在抗原、抗體等大分子物質(zhì)，這些物質(zhì)的存在可能會對分離柱或電極產(chǎn)生污染或毒害，所以有時為了檢測的要求需對樣品進行純化或預(yù)先凈化。凈化過程常用沉淀法將蛋白質(zhì)去除，或采用一個前柱來進行樣品凈化處理。

    工作電極

待測物質(zhì)的電化學(xué)行為會因為工作電極材料的不同而有區(qū)別，而且不同的電極材料的背景電流也會有所不同，因此要根據(jù)待測物質(zhì)的氧化還原性質(zhì)來選擇檢測器的工作電極。常用的電極有玻碳電極、碳糊電極、鉑電極、金電極、汞電極以及不銹鋼電極等。玻碳電極是zui常用的工作電極，它具有較寬的電位范圍，可以在正電位范圍內(nèi)檢測被測物質(zhì)的氧化電流，而且對普通有機溶劑呈惰性，氣體也不能參透，缺點是電極表面易于發(fā)生電聚合而造成污染，因此，每次測定前都要仔細處理使表面呈鏡面，以保證測定的重現(xiàn)性。碳糊電極也常用作工作電極，其背景電流低、噪聲較小、電極成本低，缺點是在含有機溶劑的流動相中膠黏劑會逐漸溶解。

 化學(xué)修飾電極也可用于HPLC的安培檢測。如在玻碳電極表面鍍上一層帶電聚合物膜，如聚4-乙烯基吡啶或陽離子交換劑Nafion ,就可以有效改善電極對相反電性被測物的分析性能。

工作電位的選擇

     在檢測過程中工作電極電位的選擇非常重要，電位較高時，待測物質(zhì)反應(yīng)*，但背景電位大、噪聲大選擇性不好，對檢測限有影響，而且工作電位與被測物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)和流動相的組成有很大的關(guān)系。工作電位的選擇可以通過循環(huán)伏安法確定，方法是將待測物質(zhì)

與流動相組成的混合溶液模擬電化學(xué)檢測器中的流出液，在常規(guī)電解池中用循環(huán)伏安實驗來了解待測物質(zhì)的電化學(xué)信息，此法較為簡單。另一種準(zhǔn)確的方法是流體動力學(xué)伏安法，它常用于安培檢測器工作電位的選擇，方法是在不同的電位下將被測物質(zhì)的溶液重復(fù)的注入HPLC，同時用檢測器記錄相應(yīng)的電流，得到不同電位下的電流曲線，一般是一個階梯形的伏安圖，每種物質(zhì)都具有特定的半波電位和極限電流。通常工作電位選擇在階梯波的平臺位置，這樣被測物質(zhì)可以*反應(yīng)，有效提高反應(yīng)的靈敏度。

安培檢測器的種類

      安培檢測器的種類很多，zui常見的有薄層式、管式和噴壁式，有關(guān)檢測器的設(shè)計可參見相關(guān)專著。一般來說檢測器的電解池設(shè)計應(yīng)滿足以下要求：具有高靈敏度和高準(zhǔn)確性，死體積小，結(jié)構(gòu)簡單，易于維護和保養(yǎng)。流動體系或安培檢測器大體被分為二類：一類是在檢測過程中，只有1%~10%的分析物被電解，稱為安培檢測器：另一類是檢測過程中分析物100%被電解稱為庫侖檢測器，不管哪一種類的檢測器，都必須在施加一個工作電為的同時檢測相應(yīng)的電流。由于電化學(xué)反應(yīng)過程僅發(fā)生在電極表面而不是整個體系內(nèi)，所以死體積的減小并不影響檢測的靈敏度。

           基本操作方法

      液相色譜安培酶免疫分析是將酶免疫分析、液相色譜分離和安培法檢測相結(jié)合的一種綜合性技術(shù)。它的基本方法是按照常規(guī)酶免疫分析的步驟完成免疫分析的過程和酶催化反應(yīng)，然后將酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物注射到液相色譜中，利用HPLC的分離作用將酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物同其他干擾物質(zhì)分離，zui后在相應(yīng)的工作電位下用安培檢測器測定酶反應(yīng)的產(chǎn)物在電極上的氧化/還原電流，進一步達到測定抗原抗體的目的。

流動注射安培酶聯(lián)免疫分析

流動注射分析（Flow injection analysis, FIA）是利用連續(xù)流動的液體來注入某體積的樣品。它具有進樣速度高（一般是100~300樣/h），響應(yīng)時間快（從樣品注入到檢測器響應(yīng)的時間一般小于1min）、儀器自動化程度高等優(yōu)點。