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ELISA檢測的干擾因素與方法

ELISA應(yīng)用zui廣，但這種固相測定技術(shù)非無缺，把握實驗過程中每一個可能出現(xiàn)差錯的關(guān)鍵性問題，采取相應(yīng)的舉措，才有可能使實驗性誤（漏）診減少到zui低限度。

 1. 表面效應(yīng)

首先必須明確指出的是，：“固相”ELISA與傳統(tǒng)的“液相”血清學(xué)試驗的zui大.zui本質(zhì)的區(qū)別是有一個預(yù)先固相抗原或抗體到載體表面的步驟，以及抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)由液態(tài)環(huán)境移

到了固相載體表面進(jìn)行。蛋白質(zhì)分子在吸附過程中，為了克服與固相載體之間的排斥力，需要重新分布其表面的功能性基因，使疏水性基因充分暴露，然后，局部接觸區(qū)域的偶極分子脫氫，再通過范德瓦爾斯力吸引而固相到載體表面。                                                      表面效應(yīng)可直接影響抗原，抗體的構(gòu)象和功能。此外，表面效應(yīng)亦影響抗原和抗體結(jié)合反應(yīng)的動力學(xué)過程。

（1）    固相導(dǎo)致抗原的變化  為了測定抗體水平，需預(yù)先將抗原固相（包被）到極性和

水性的聚苯乙烯（PS）或聚氯乙烯（PVC）酶標(biāo)板上。用直接物理吸附方法固相蛋白抗原及DNA等，導(dǎo)致的變化是多方面的，可引起分子構(gòu)象和抗原性發(fā)生改變。酶活性測定時可消失。牛血清白蛋白固相之后，其抗原價可由5價降為1價。此外，發(fā)現(xiàn)被動吸附方法固相鐵蛋白，呈團(tuán)串狀，不均一的 隨機(jī)分布，這種影響質(zhì)控的情況具有普遍性。zui后，大多數(shù)小分子半抗原不易直接吸附到載體表面。解決這一難題的方法，一般是采用在小分子 抗原上，先偶聯(lián)上葡聚糖，明膠等手臂后再進(jìn)行固相包被。對于有多重表達(dá)抗原決定簇的大分子抗原，用抗體橋式包被法可避免表面效應(yīng)的影響。將蛋白抗原吸附于膠體AI（OH）3后再固相也可以避免蛋白變性。用Y射線輻照（400GY）PS板，不但可增加蛋白抗原吸附能力，而且還有降低抗體測定本底的作用。

（2）    固相對抗體的影響   直接吸附固相抗體（Igs）分子，除了呈團(tuán)串狀，不均分布和易解吸等一般不利因素之外，Igs分子攤開在載體表面，不但構(gòu)象發(fā)生改變，而且影響抗體的活性，如IgG的結(jié)合價減少，可由2價變?yōu)?span lang="EN-US">1價，甚至*失活。實驗結(jié)果表明，單克隆抗體比多克隆抗體更易失活，固相后仍能保持結(jié)合能力的分子僅占少數(shù)，分別為3%和5%-10%。這不但浪費抗體試劑，更可惜的是空置了有限的微孔表面積。抗體分子N末端為Fab，C末端為Fc，直接被動吸附的隨意性，造成一部分Fab，C末端為Fc，直接被動吸附的隨意性，造成一部分Fab結(jié)合位點朝向載體一面，或因用量過多而造成的重疊吸附，部分Fab結(jié)合位被遮蓋，均可導(dǎo)致其總體結(jié)合能力下降。為此，出現(xiàn)了可以“錨定”F.段在載體表面，而使Fab朝外的共價結(jié)合法，即在載體上導(dǎo)入氨基 肼基等活性基因，然后在水溶性碳二胺作用下，與Igs的羧基共價結(jié)合，或直接與羥基化糖基產(chǎn)生的醛基共價結(jié)合：含溴乙烯基團(tuán)的PS板，可在雙功能交聯(lián)劑如戊二醛的幫助下與蛋白質(zhì)共價結(jié)合。目前，國外已有有關(guān)的酶標(biāo)板產(chǎn)品（）供應(yīng)。

橋式法是一種避免Igs與載體直接接觸的固相方法，有幾種不同的類型：（1）抗抗體法：（2）SPA法：（3）鏈酶親和素生物素法，這一種方法應(yīng)用 zui為成功，只要預(yù)先將*捕捉抗體生物素化：（4）抗半抗原抗體法，這需要將捕捉體預(yù)先記半抗原。

   （3）抗體介導(dǎo)的抗原分子變構(gòu)  抗原與抗體分子在三維立體空間自由運動，互相碰撞，彼此特異性結(jié)合，這種結(jié)合不似早期相像中的單純的“鎖-匙”關(guān)系，而是一種柔性的誘導(dǎo)契合?？乖肿記Q定簇可以突入到Fab的深底部，反過來，Fab為了執(zhí)行其固有生物學(xué)功能，主動地發(fā)生變角折彎，錐形轉(zhuǎn)動及zuiN末端可變區(qū)的“球穴”擺動，以契合抗原決定簇，Fab亦可突入到大分子抗原的較深的位區(qū)。液態(tài)中的抗原體分子在完成一級結(jié)合反應(yīng)之后，該復(fù)合物可以通過抗原抗體之間的特異性結(jié)合，亦可通過抗體Fc-Fc段的非特異性結(jié)合而進(jìn)一步交聯(lián)，形成肉眼可見的晶格形網(wǎng)絡(luò)沉淀凝集型的抗原抗體二級反應(yīng)復(fù)合物?？v觀全過程，抗原分子一般總能保持其固有的構(gòu)象，而復(fù)合物中的抗體構(gòu)象變化則較大。相反，在固相抗體測定抗原的過程中，由于表面效應(yīng)的關(guān)系，抗體介導(dǎo)的抗原分子變構(gòu)具有特殊意義。

2. HD-HOOK效應(yīng)

這種發(fā)生在固相法試驗過程中的可造成“假低值”甚至“假陰性”錯誤結(jié)果的特殊效應(yīng)，稱為“高劑量鉤鐮（HD-HOOK）效應(yīng)”。它的產(chǎn)生條件、分子基礎(chǔ)、導(dǎo)致的后果等，都與傳統(tǒng)的液相沉淀、凝集反應(yīng)中的“區(qū)帶現(xiàn)象”不一樣。在一步二位點夾心ELISA中，主要是因為待測抗原的總量過高，競爭結(jié)合反應(yīng)系統(tǒng)中的*標(biāo)記二抗，從而產(chǎn)生抗原越多，zui終反應(yīng)信號越低的HD-HOOK效應(yīng)，如HBsAg等可出現(xiàn)假陰性?？乖?ldquo;量”是決定的因素，一般認(rèn)為二步二位點夾心固相測定法不會產(chǎn)生抗原過剩的“陰滯現(xiàn)象”之觀點，早已被Miles的實踐否定，只是并非所有二步夾心法都會產(chǎn)生HD-HOOK效應(yīng)。迄今為止，僅少數(shù)具有多重抗原決定簇的大分子蛋白質(zhì)抗原，如鐵蛋白、前列腺特異抗原（PSA）、人絨毛膜促性腺激素（HCG）、甲胎蛋白（Afp）、細(xì)胞溶素-D等，本身具有分子變構(gòu)內(nèi)因的抗原，測定時發(fā)現(xiàn)了HD-HOOK效應(yīng)?？乖?ldquo;質(zhì)”的特性是決定的因素，而標(biāo)記二抗介導(dǎo)抗原分子變構(gòu)是重要的外因。當(dāng)然抗原的數(shù)量亦是*的相關(guān)因素。以鐵蛋白為例，被捕捉的鐵蛋白抗原分子，與親和性比一抗大的標(biāo)記二抗發(fā)生交叉重疊結(jié)合后，由于立體效應(yīng)，可促使鐵蛋白分子變構(gòu)，使其與一抗解離，形成標(biāo)記二抗與鐵蛋白分子復(fù)合物，而被隨后的洗滌過程洗離出去，zui終的信號下降。在劑量反應(yīng)曲線的高劑量（HD）區(qū)段，其線型走向不是呈平臺狀無限后延，而呈向下彎落狀，似一只鉤或一把鐮刀（HOOK）.若單純從劑量反應(yīng)曲線的鉤狀圖形來看，與區(qū)帶現(xiàn)象中抗原過剩型復(fù)合物的“后帶現(xiàn)象”十分相似。然而，其分子基礎(chǔ)*不同，“晶格理論”僅能解釋區(qū)帶現(xiàn)象，而對固相二步夾心ELISA的HD-HOOK效應(yīng)的解釋，目前認(rèn)為，“抗原分子變構(gòu)理論”比較貼切。

     克服HD-HOOK效應(yīng)，主要依靠試劑盒的生產(chǎn)廠家。首先，對靶抗原的決定簇應(yīng)盡可能弄清楚，在此基礎(chǔ)上，選擇僅有一種而且僅有兩個重復(fù)表達(dá)的決定簇，或者兩種且每種僅有一個表達(dá)的決定簇，選用相應(yīng)的一個單抗，或者兩個相應(yīng)單抗來組建藥盒，有可能從根本上解決HD-HOOK效應(yīng)的弊端。作為應(yīng)用者，可用稀釋測定法解決這一問題。                                       在測定未知標(biāo)本的aFP值時候，用原標(biāo)本與10倍稀釋的標(biāo)本同時測定，發(fā)現(xiàn)原倍孔A值低于稀釋孔，證實了HD-HOOK的存在，從而避免了實驗的誤（漏）診。

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