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TRIzon總RNA提取試劑說(shuō)明書(shū)

TRIzon Reagent

目錄號(hào)：K0580

保存條件：2-8℃避光保存。

組分說(shuō)明

                 Cat. No.                  K0580        K0580A

                 TRIzon Reagent        20 ml        100 ml

              本產(chǎn)品僅供科研使用，請(qǐng)勿用于臨床診斷及其他用途  

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

　　TRIzon是廣譜型總RNA提取試劑。實(shí)驗(yàn)操作快速方便，顏色鮮明，便于分層。本

試劑適用范圍廣泛，可以從動(dòng)物組織、植物材料、各種微生物及培養(yǎng)細(xì)胞等樣品中提

取總RNA。樣品在TRIzon中被充分裂解的同時(shí)能夠最大限度地保證 RNA的完整性。在

加入氯仿離心后，溶液會(huì)分成三層：上層無(wú)色水相、中間層和下層紅色有機(jī)相，RNA

分布在上清層中。收集上清層后，經(jīng)異丙醇沉淀便可以回收得到總RNA。提取的總

RNA完整性好，無(wú)蛋白和 DNA污染，可用于各種分子生物學(xué)常規(guī)實(shí)驗(yàn)，如 RT-PCR、

Real-time RT-PCR、Northern Blot、Dot Blot、體外翻譯等。

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備及重要注意事項(xiàng)

1．預(yù)防RNase污染，應(yīng)注意以下幾方面：

   1）使用無(wú)RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。

   2）玻璃器皿應(yīng)在使用前于180℃高溫下干烤4小時(shí)，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸

   泡10分鐘，用水*沖洗后高壓滅菌。

   3）配制溶液應(yīng)使用無(wú)RNase的水。

   4）操作人員戴一次性口罩和手套，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要勤換手套。

2．提取的樣品避免反復(fù)凍融，否則影響RNA提取得率和質(zhì)量。

3．本品中含有苯酚，具有毒性和腐蝕性。如果吸入體內(nèi)、接觸皮膚、吞食等會(huì)導(dǎo)致中

   毒、灼傷以及其他身體傷害。使用本制品時(shí)應(yīng)穿戴防護(hù)物品，如防護(hù)服裝、手套、

   眼罩、面罩等。如果不小心接觸到眼睛，應(yīng)立即用大量的水沖洗并前往醫(yī)院治療。

4．樣品用TRIzon 勻漿后，如不即刻加入氯仿，置于-70℃下可放置一個(gè)月以上。

5．保存在75%乙醇中的RNA沉淀，2-8℃可以保存一周，-20℃條件下可以保存1年。

   RNA半衰期比較短，容易降解，建議提取后盡快進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，如反轉(zhuǎn)錄成cDNA，

   Northern Blot等。

6．若下游實(shí)驗(yàn)對(duì)DNA非常敏感，建議用不含RNase的DNase  I（貨號(hào)：YJ2090A）對(duì)

   RNA進(jìn)行處理。

自備試劑：氯仿、異丙醇、75%乙醇、無(wú)RNase的水（新開(kāi)封或提取RNA專用）。

操作步驟

1．各種材料的處理

   1a.植物組織：取新鮮植物組織在液氮中充分研磨或?qū)⒅参锝M織剪碎后直接在TRIzon

   中迅速研磨，每30-50 mg組織加入1 ml TRIzon，混勻。

   注意：樣品體積一般不要超過(guò)TRIzon體積的10%。

   1b.動(dòng)物組織：取新鮮或-70℃凍存的動(dòng)物組織盡量剪碎，每30-50 mg組織加入1 ml

   TRIzon，勻漿儀進(jìn)行勻漿處理?；蛟谝旱醒心ズ蠹尤?/span>TRIzon 1 ml混勻。

   注意：樣品體積一般不要超過(guò)TRIzon體積的10%。

   1c.單層培養(yǎng)細(xì)胞：吸去培養(yǎng)液，可直接在培養(yǎng)板中加入適量TRIzon（每10 cm²面積

   需要1 ml TRIzon），用取樣器反復(fù)吹打使細(xì)胞裂解。也可用胰蛋白酶處理后，將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移至RNase-Free的離心管中，300×g離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，仔細(xì)吸除所有上清，加入TRIzon 1 ml混勻。

   注意：1）收集細(xì)胞數(shù)量不要超過(guò)1×10⁷。

         2）TRNzol加量根據(jù)培養(yǎng)板面積決定，不是由細(xì)胞數(shù)決定。如果TRIzon加量不足，可能導(dǎo)致提取的RNA中有DNA污染。

   3）收集細(xì)胞時(shí)一定要將細(xì)胞培養(yǎng)液去除干凈，否則會(huì)導(dǎo)致裂解不*，造成RNA的產(chǎn)量降低。

   1d.細(xì)胞懸液：離心收集細(xì)胞。每5×10⁶   -1×10⁷動(dòng)物、植物和酵母細(xì)胞或每10⁷細(xì)菌

   注意：細(xì)胞加入1）加入1 mlTRIzon TRIzon前不要洗。 滌細(xì)胞，以免RNA降解。

   2）一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞可能需要?jiǎng)驖{儀或液氮研磨處理。

1e.血液處理：直接取新鮮的血液，加入3倍體積TRIzon（推薦0.25 ml全血加入0.75 ml

   TRIzon），充分振蕩混勻。

   1f.可選步驟：對(duì)于蛋白、脂肪、多糖或胞外物質(zhì)含量高的樣品，如肌肉組織、脂肪組

   織或植物的塊莖，可以在勻漿處理后4℃，12,000 rpm（~13,400×g）離心10分鐘以除去不溶物質(zhì)，此時(shí)沉淀中含胞外物質(zhì)、多糖和高分子量的DNA，而RNA存在于上清中。

2．樣品中加入TRIzon后反復(fù)吹打幾次，使樣本充分裂解。室溫放置 5分鐘，使蛋白核

   酸復(fù)合物*分離。

3．向以上溶液中加入氯仿，每使用1 ml TRIzon加入0.2 ml氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩

   15秒，室溫放置2-3分鐘。

4．4℃ 12,000  rpm離心15分鐘，此時(shí)樣品分成三層：紅色有機(jī)相，中間層和上層無(wú)色

   水相，RNA 主要在水相中，把水相（約600 μl）轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的RNase-Free離心管

   （自備）中。

    5．在得到的水相溶液中加入等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10分鐘。

    6．4℃ 12,000 rpm離心10分鐘，棄上清。

    7．加入75%乙醇（用無(wú)RNase的水配制）洗滌沉淀。每使用1 ml TRIzon用1 ml 75%乙醇對(duì)沉淀進(jìn)行洗滌。

    8．4℃ 12,000 rpm離心3分鐘，小心吸棄上清，注意不要吸棄RNA沉淀。

       注意：剩余的少量液體可短暫離心，然后用槍頭吸出，注意不要吸棄沉淀。

    9．室溫放置2-3分鐘，晾干。加入30-100 μl無(wú)RNase的水，充分溶解RNA，得到的RNA   保存在-70℃，防止降解。

       注意：沉淀不要過(guò)分干燥，以免難于溶解。

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