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021-65232515
pBM16A Toposmart Cloning Kit
產(chǎn)品信息: |
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組 成 | YCL071-01 | YCL071-02 |
pBM16A Vector (20ng/ml ) | 20ml | 20ml×3 |
10×Toposmart | 20ml | 20ml×3 |
Control Insert | 5ml | 5ml |
M13F Primer | 0.1OD | 0.1OD×3 |
M13R Primer | 0.1OD | 0.1OD×3 |
保存條件:-20℃保存,有效期一年。
產(chǎn)品介紹:
pBM16A Toposmart克隆試劑盒利用痘苗病毒的拓?fù)洚悩?gòu)酶I(Topoisomerase I)的切割再連接的特點(diǎn)將片段克隆到載體中。不僅適用于克隆由Pfu、KOD、Xerox、Phusion 和Q5等高保真DNA聚合酶擴(kuò)增的平末端PCR產(chǎn)物,也可克隆由Taq、Tth和klenTaq等DNA聚合酶擴(kuò)增的帶A尾的PCR產(chǎn)物。試劑盒中的pBM16A載體為線性化的質(zhì)粒??梢杂靡飳?duì)M13F和M13R進(jìn)行菌落PCR鑒定陽性克隆。
(1)連接反應(yīng)僅需5 分鐘。
(2)適用于平末端PCR產(chǎn)物和帶A尾的PCR產(chǎn)物。
(3)載體采用了新的制備工藝,無需藍(lán)白斑篩選。
1. 連接反應(yīng)
按下表,在一個(gè)0.2ml PCR 管中依次加入加完試劑后,輕輕混勻低速離心,使溶液集中在管底。
成分 | 體積 |
DNA -*片段 | 0.5-8µl |
pBM16A Topo載體 | 1ml |
10×Toposmart | 1ml |
補(bǔ)水至總體積 | 10ml |
注意:此步驟不要在低溫條件下(冰水浴)上操作。
2. 反應(yīng)溫度及片段要求
室溫下(20-30℃)放置 0-5 分鐘,然后將離心管放置在冰上。如當(dāng)天不進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。請(qǐng)將連接產(chǎn)物置于-20℃保存。
注意:DNA-*片段的用量見下表
片段大小(bp) | 建議用量(ng) |
100-1000 | 20-50 |
1000-2000 | 50-100 |
2000-5000 | 100-200 |
室溫下(20-30℃)反應(yīng)時(shí)間 5-30 分鐘,如果室溫較低,推薦使用 PCR 儀器控制溫度。可以設(shè)置 25℃反應(yīng) 5 分鐘。如果 PCR 產(chǎn)物電泳檢測僅有很銳利明亮的條帶,無引物二聚體和非特異性條帶存在,可直接取 0.5-1µl PCR 產(chǎn)物原液進(jìn)行克隆。
取1µl 試劑盒提供的1kb長度的對(duì)照片段LacZ 基因α肽片段進(jìn)行克隆,轉(zhuǎn)化具有α 互補(bǔ)功能的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(如 DH5α,*0,Mach1-T1 等)。菌液涂布在含有IPTG,X-gal 的LB 氨芐平板上,次日藍(lán)色菌落為陽性克隆,說明有片段插入,白色菌落為空載體。
1.取5µl 連接產(chǎn)物到50-100µl 剛剛?cè)诨母惺軕B(tài)細(xì)胞中,輕輕混勻,冰浴2-30 分鐘。
2.42℃水浴中熱擊30 秒鐘。
3. 立刻置于冰水浴中2 分鐘。
加入300-500µl 無菌的不含抗生素的SOC 或LB,37℃,200-250rpm 振蕩培養(yǎng)60 分鐘。
5. 陽性重組子的鑒定菌落 PCR
(1) 菌落PCR方法鑒定陽性克隆
① 用10ml吸頭挑選克隆至預(yù)先加有10μl無菌水或LB培養(yǎng)基的PCR管中,吹打混合。
② 25ml PCR反應(yīng)體系:取2μl細(xì)菌懸液為模板、加入5μM 濃度的M13F/M13R各
1μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
③PCR擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5分鐘(裂解細(xì)胞,失活核酸酶),94℃變性10秒鐘,55℃退火10秒鐘,72℃延伸( 根據(jù)片段的大小決定延伸時(shí)間,通常每1min/1kb)X秒,30個(gè)循環(huán),72℃后延伸5分鐘。1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果,有強(qiáng)烈的明顯條帶的克隆為重組體,與插入片段大小相近(M13F/M13R 引物在克隆位置的兩側(cè),所以PCR擴(kuò)增出的DNA的長度比插入片段大138bp) 可視為陽性克隆。菌落PCR方法鑒定重組子時(shí)一定要設(shè)立一個(gè)不加菌液的陰性對(duì)照。
(2) 測序:用M13F、M13R通用引物對(duì)陽性質(zhì)粒進(jìn)行測序分析。
pBM16A載體圖譜
重組子克隆菌少,或陽性率低:
(1) 感受態(tài)效率低,使用轉(zhuǎn)化效率>5×107cfu/µg 的感受態(tài)細(xì)胞
(2) 連接反應(yīng)在低溫下(如放碎冰上)操作,應(yīng)該在室溫下操作。
(3) PCR 片段加入量太多或太少,按照推薦量加入。
(4) PCR 純度低,重新擴(kuò)增或重新純化PCR 產(chǎn)物。
(5) PCR 質(zhì)量低,切膠時(shí)在紫外下照射時(shí)間長,需重新制備。
(6) PCR 擴(kuò)增結(jié)束后,應(yīng)該再延伸5-10 分鐘,確保片段延伸*。
(7) 轉(zhuǎn)化后沒有復(fù)蘇培養(yǎng),可以加入SOC 或LB,培養(yǎng)60分鐘。
>pBM16A Topo AGTGAGTTGATTGTGTAAAACGACGGCCAGTGTCTGAGGCTCGCTTCAGTCCTGATGCTTGATATCCCGGGCGT GTCGCCCTT$$$$AAGGGCGACACGCCCGGGATATCGCGTCTGCCTGAAGTCAATACTGACGATGGTCATAGCT GTTTCCTGTCCATAGCAGAAAGTCAAAAGCCTCCGACCGGAGGCTTTTGACTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCC AACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGA AGCTAAAATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCACTTATTCCGTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTG CTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTG GATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGT TCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTC AGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGC AGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCT AACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCA TACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAA CTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCG CTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGCTCTCGCGGTATCATTG CAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGAT GAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAATGAGGGCCCAAATGTAATCA CCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATC ACAAAAATCGATGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGA AGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAG CGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTG TGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGA CACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGA GTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAG TTACCTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTT GCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATTTTCTACCGAAGAAAGGCCCAC CCGTGAAGGTGAGCC
本產(chǎn)品僅供研究不用于臨床診斷
實(shí)驗(yàn)代做服務(wù):
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