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高純度質粒大量快速提取試劑盒

HighPure Rapid Maxi Plasmid Kit

保存條件：本產品收到后按照上面指示溫度存放各成份，儲存 18 個月不影響使用效果。

產品介紹：

本試劑盒采用改進 SDS-堿裂解法裂解細胞，離心吸附柱內的硅基質膜在高鹽、低pH 值狀態(tài)下選擇性地結合溶液中的質粒 DNA，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質和其它細菌成分去除，后低鹽、高 pH 值的洗脫緩沖液將純凈質粒 DNA 從硅基質膜上洗脫。

產品特點：

離心吸附柱內硅基質膜全部采用進口特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復性好。克服了國產試劑盒膜質量不穩(wěn)定的弊端。

不需要使用有毒的苯酚、氯fang等試劑，也不需要乙醇沉淀?？焖佟⒎奖?，從 100-200ml 大腸桿菌 LB 培養(yǎng)液中，可快速提取 0.2-0.5mg 純凈的高拷貝質粒 DNA，提取率達80 %左右。

 3. 獲得的質粒產量高、超螺旋比例高、純度好，可以直接用于酶切、轉化、PCR、體外轉錄、測序等各種分子生物學實驗。

注意事項：

1. 第--次使用時，將試劑盒所帶全部的 RNase A 加入溶液 P1 后（終濃度 100μg/ml） 置于 4℃保存。如果溶液 P1 中 RNase A 失活，提取的質粒可能會有微量 RNA 殘留， 在溶液 P1 中補加 RNase A 即可。

2. 環(huán)境溫度低時溶液 P2 中 SDS 可能會析出出現(xiàn)渾濁或者沉淀，可在 37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復澄清，不要劇烈搖晃，以免形成過量的泡沫。

3. 避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發(fā)、氧化、pH 值變化。

4. 溶液 P3 和去蛋白液 PD 中含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染皮膚、眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

5. 提取質粒的量與細菌培養(yǎng)濃度、質粒拷貝數(shù)等因素有關。如果所提質粒為低拷貝質?；虼笥?10kb 的大質粒，應加大菌體使用量，同時按比例增加 P1、P2、P3 的用量， 洗脫緩沖液應在 70℃預熱?？梢赃m當?shù)难娱L吸附和洗脫的時間，提高提取效率。

得到的質粒 DNA 可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。OD260 值為 1 相當于大約 50μg/ml DNA。電泳可能為單一條帶，也可能為 2 條或者多條DNA 條帶，這主要是不同程度的超螺旋構象質粒泳動位置不一造成，與提取物培養(yǎng)時間長短、提取時操作劇烈程度等有關。本公司產品正常操作情況下基本超螺旋可以超過 90%。洗脫液 EB 不含有螯合劑 EDTA，不影響下游酶切、連接等反應。也可以使用水洗脫， 但應該確保 pH 大于 7.5，pH 過低影響洗脫效率。用水洗脫，質粒應該保存－20℃。質粒DNA 如果需要長期保存，可以用 TE 緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl，1mM EDTA， pH 8.0），但是 EDTA 可能影響下游酶切反應，使用時可以適當稀釋。

自備試劑：無水乙醇

操作步驟：

提示：

ð 第--次使用前請先在漂洗液 WB 瓶中加入 200ml 無水乙醇，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入!

ð 將 RNase A 全部加入溶液 P1 中，混勻。每次使用后置于 2-8℃保存。

ð 將溶液 P3 放在冰上預冷。

1. 柱平衡步驟：向吸附柱 AC 中（吸附柱放入收集管中）加 1ml 平衡液 BL，12,000rpm

離心 1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。（請使用當天處理柱子）

2. 取 100-200 毫升過夜培養(yǎng)的菌液，6000xg 離心 10 min，盡可能的倒干上清，收集菌體。

3. 用 7ml 溶液P1 重懸菌體沉淀，移液器吹打或者渦旋振蕩至*懸浮。

4. 加 7ml 的溶液P2，溫和地上下翻轉 4 -7 次使菌體充分裂解，室溫放置 4 min。

5. 加 10ml 溶液 P3，立即溫和地上下翻轉 4 -7 次，充分混勻此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。冰上靜置 5-10 min，4℃條件下 2500xg 離心 20 min(加大離心力可相應縮短離心時間, 如 15000xg 離心 10 min)，小心取上清，避免吸取到漂浮的白色沉淀。

6. 將上一步所得上清加入吸附柱 AC 中（吸附柱放入收集管中），靜置 2 min，2500xg

離心 2 min，倒掉收集管中的廢液。

7. 加入 10ml 去蛋白液 PD，2500xg 離心 2 min，棄掉廢液。

8. 加入 10ml 漂洗液 WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），2500xg 離心 2 min，棄掉廢液。

9. 重復操作步驟 8。

將吸附柱 AC 放回空收集管中，g速（h大于 9000xg，如果離心機轉速低，需要相應延長離心時間）離心 10 min，去除基質膜上的乙醇殘留，用槍頭吸除內圈壓環(huán)和柱壁之間可能殘留的乙醇，室溫或者烘箱晾干幾分鐘。

11. 可選步驟: 選擇以下兩種方法之一干燥柱子：

a. 取下柱子放置于真空容器中，密封真空容器，提供真空 15 min；

b. 將柱子放置于 60-65℃真空干燥箱或烘箱中，放置 10-15 min。

12. 取出吸附柱 AC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加 1-1.5ml 洗脫緩沖液EB（事先在 65-70℃水浴中預熱效果更好），室溫放置 2 min，6000xg 離心 5 min。需要較多量質粒，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，離心 2 min。（注意：洗脫液的 pH 值對于洗脫效率有很大影響。(注意：若用 ddH2O 做洗脫液應保證其 pH 值在 7.5-8.0 圍內，pH 值低于 7.0 會降低洗脫效率。洗脫緩沖液用量的多少主要是依據(jù)質粒的拷貝數(shù)以及實驗所需要的濃度來確定。洗脫緩沖液體積不少于 1 ml，體積過小影響回收效率。DNA 產物應保存在-20℃，以防 DNA 降解。）

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