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一步法快速WB(HRP)試劑盒(鼠)說明書
One Step Western Kit HRP(Mouse)
目錄號(hào): K2030
保 存: 2 - 8 ℃,避免冷凍
組分說明
Cat. No. K2030 K2030A K2030B
Kit Size 10 2 50
封閉液 125 ml 30 ml 500 ml
抗體反應(yīng)液 HRP(鼠) 1 ml 200 μl 5×1 ml
抗體稀釋液 125 ml 30 ml 500 ml
漂洗液(10×) 125 ml 30 ml 500 ml
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
一步法快速WB 試劑盒(鼠)是上海研謹(jǐn)生物xin推出的Western Blot 檢測(cè)試劑盒,能夠在1 小時(shí)左右得到高質(zhì)量的 Western Blot 結(jié)果,且操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏度高、背景低、不需再加入二抗、系統(tǒng)穩(wěn)定性強(qiáng)。常規(guī)的Western Blot 間接 法檢測(cè)過程(封閉、一抗結(jié)合和二抗結(jié)合)需要較長(zhǎng)的時(shí)間,實(shí)驗(yàn)流程復(fù)雜且需要多步條件優(yōu)化。膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到載體膜上后,使用試劑盒中的封閉液孵育5 min,再用抗體反應(yīng)液處理后的一抗孵育載體膜,經(jīng)洗滌三次(每次5 分鐘)后,即可進(jìn)行發(fā)光或顯色檢測(cè)。本試劑盒針對(duì)目的蛋白一抗為鼠來源的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)使用。
注意事項(xiàng)
1. 客戶自己準(zhǔn)備鼠來源的一抗。
2. 使用封閉液、抗體稀釋液(鼠)、漂洗液之前請(qǐng)充分混勻。
3. 漂洗液如在2-8 ℃保存時(shí)出現(xiàn)沉淀,請(qǐng)恢復(fù)到室溫,把沉淀溶解后正常使用,1×漂洗液可在室溫保存一個(gè)月。
4. 建議轉(zhuǎn)膜完成后用麗春紅等試劑染色,并把膜上多余部分剪去以增加試劑的使用效率。
5. 一抗和抗體反應(yīng)液HRP(鼠)需要通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定jia的稀釋用量。
6. 抗體反應(yīng)液HRP(鼠)、抗體稀釋液和抗體用量可根據(jù)膜的大小按比例放大或減少。
7. 加入一抗的抗體稀釋液可以回收重復(fù)使用一次。特異性及親和力不好的抗體建議不重復(fù)回收使用?;厥蘸罂贵w如在1-2天內(nèi)使用放置在2-8 ℃,長(zhǎng)期保存請(qǐng)?jiān)?20℃凍存,避免多次反復(fù)凍融。
8. 如果存在較高背景的情況,請(qǐng)調(diào)整抗體的用量,并增加洗膜次數(shù)。
9. 試劑盒內(nèi)所有試劑請(qǐng)于2-8 ℃保存,避免凍融。
操作步驟
本產(chǎn)品適用于轉(zhuǎn)膜完成后的封閉及抗體孵育步驟,以5 cm×8 cm 膜為例:
1. 漂洗液準(zhǔn)備:取10 ml 10×漂洗液用蒸餾水稀釋至100 ml,待用。每次洗膜用8-10 ml。
2. 轉(zhuǎn)膜完成后,將膜浸沒到10 ml封閉液中,室溫封閉5分鐘。
3. 倒掉封閉液,加入8-10 ml 1×漂洗液,于搖床上用較大速度漂洗1分鐘。
4. 洗膜的同時(shí)可準(zhǔn)備抗體孵育液:取抗體反應(yīng)液HRP(鼠)100μl到EP管中,加入鼠源一抗3-10μg,槍頭吸打至充分混勻,室溫孵育5分鐘。
5. 將混勻的抗體與反應(yīng)液HRP(鼠)混合液加入到10 ml 抗體稀釋液中,充分混勻。
注意:1)一抗的用量也可根據(jù)抗體的稀釋度來進(jìn)行調(diào)整。以抗體的終稀釋度1:1000為例,取100μl抗體反應(yīng)液HRP(鼠)到EP管中,加入10μl一抗,加入到10 ml 抗體稀釋液中,充分混勻,室溫孵育5分鐘。
2)如果膜面積較小,可按比例減少抗體、反應(yīng)液及稀釋液的用量。
6. 步驟3中,洗膜完成后,倒掉漂洗液,將一抗、反應(yīng)液及稀釋液混合而成的抗體孵育液加到膜上(確保孵育液*浸沒膜表面),在搖床上以適當(dāng)速度室溫孵育40分鐘。
7. 棄去(回收)抗體稀釋液,用1×漂洗液漂洗3-5次,每次3分鐘。
8. 進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。建議采用ECL或者沉淀型TMB法進(jìn)行檢測(cè)。
應(yīng)用實(shí)例
A: 普通WB對(duì)照:beta-actin鼠單抗(YJ0096)5ug室溫孵育40min,洗膜后二抗羊抗鼠-HRP
(YJ0102)1:10000稀釋,室溫40min,ECL(YJ0049)曝光
B: 一步法WB: beta-actin鼠單抗(YJ0096)5ug 室溫孵育40min ,ECL(YJ0049)曝光
實(shí)例一 抗原為 293T 細(xì)胞全裂解液(YJ0065)
C:普通 WB 對(duì)照:GST 鼠單抗(K0084)2.5ug 室溫孵育40min,洗膜后二抗羊抗鼠-HRP
(K0102)1:10000 稀釋,室溫40min,ECL(K0049)曝光。
D:一步法WB: GST 鼠單抗(K0084)2.5ug 室溫孵育40min ,ECL(K0049)曝光。
實(shí)例二 抗原為 E.coli 多標(biāo)簽蛋白裂解液(K2016)
常見問題及解決辦法
問題:信號(hào)太弱或者看不到條帶
可能原因:
a蛋白上樣量太少
b蛋白轉(zhuǎn)膜效率太低
c一抗親和力較低
解決方案:
A 進(jìn)行SDS-PAGE電泳時(shí)加大上樣量。
B 優(yōu)化轉(zhuǎn)膜時(shí)間或者電流,確保轉(zhuǎn)膜時(shí)膜與膠之間沒有氣泡。
C 增加膜在溶液(含有mixture 1的WB-2)中的孵育時(shí)間。 增加抗體濃度可
以增加信號(hào)。
D 對(duì)于低親和力抗體來說,減少洗膜時(shí)間可以增加信號(hào)。由每次10min,減少到每次5min 可以增加信號(hào)。
問題:背景偏高
可能原因:
a 一抗使用過量
b一抗有非特異性結(jié)合或者與封閉試劑有交叉反應(yīng)
c洗膜時(shí)間太短
d曝光顯影時(shí)間過長(zhǎng)
e容器或者試劑被污染
解決方案:
A 減少一抗的使用量,相應(yīng)的減少WB-1用量。
B 使用 pretreat A-b(M01052)??蛻暨€可以使用 Quick Block Optimization kit 來找到j(luò)ia的封閉試劑。
C 增加洗滌的步驟可以進(jìn)一步的降低背景。
D 減少曝光時(shí)間。如果信號(hào)和背景都高,可以等待一段時(shí)間,等背景信號(hào)減弱后,再進(jìn)行 曝光。
E 每次洗滌的時(shí)候使用清潔的容器。帶手套,使用清潔的鑷子處理膜。
實(shí)驗(yàn)代做服務(wù):
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