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喹諾酮類

快速檢測試劑盒說明書

一、原理

    試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物喹諾酮類藥物和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗喹諾酮類藥物抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留喹諾酮類藥物的含量成負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物喹諾酮類藥物的含量。

二、試劑盒特性

• 試劑盒靈敏度：      0.1ppb
• 孵育溫度：          25℃
• 孵育時間：          30min～15min
• 樣本檢測下限

組織 、血清 ········································  1ppb

• 交叉反應(yīng)率

恩諾沙星（ENR）   ··························    100%

環(huán)丙沙星（CIF）   ····························    100%

氧氟沙星（OFL）    ··························    60%

奧索利酸（OXO）  ···························  116.86%

達氟沙星（DAN）  ···························  102.63%

諾氟沙星（NOR）  ···························  148.65%

洛美沙星（LOM）  ··························   86.24%

培氟沙星（PEF）   ··························  156.60%

依諾沙星（ENO）  ···························   98.97%

氟喹酸（FLU）    ···························   96.73%

麻保沙星（MAR）  ··························  110.63%

氨氟沙星（AMI）  ···························   98.86%

那氟沙星（NAD）  ···························   56.81%

• 樣本回收率

組織、血清 ·································     85±20%

三、試劑盒組成

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：微孔酶標儀、打印機、均質(zhì)器 、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

微量移液器：單道 20～200ul、單道100～1000ul、多道 250 ul

五、樣本前處理步驟

• 樣本處理前須知

處理任何樣本時，都必須注意：

（a） 實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（b） 實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

• 樣本前處理需配制：

配液1  樣本復(fù)溶液 

將20X濃縮復(fù)溶液用去離子水按1：19（1份濃縮復(fù)溶液+19份去離子水）進行稀釋。

• 樣本處理：

a）組織樣本處理方法

1、稱1.0±0.05g 均質(zhì)過的組織樣本于50ml離心管中；

2、加入10ml樣本復(fù)溶液，振蕩3min，4000r/min以上，15℃離心10min；

3、取上清50µl液體用于分析。

     樣本稀釋倍數(shù)：10

b）血清樣本處理方法

• 取50µl澄清的血清，加入450µl 樣本復(fù)溶液混合，混勻30S（如果血清樣本渾濁，將樣本于10℃，4000r/min以上離心10min，分離出血清或過濾血清，直至得到澄清的樣本）；
• 取50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  10倍  

六、 酶標免疫分析程序:

• 測定前應(yīng)須知：

• 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。
• 使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
• 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
• 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

• 操作步驟：

• 將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出并將所需試劑從試劑盒取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
• 按需要取出微孔條及板架，將不用的微孔板重新密封，保存于2-8℃，不要冷凍。
• 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
• 編號：將樣本和標準品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標準品均需做2孔平行，并記錄標準孔的樣本孔所在的位置。
• 加標準品/樣本50µl /孔，然后加酶標記物50μl/孔，再加入抗體工作液50µl/孔。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環(huán)境反應(yīng)30min。
• 用洗滌液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
• 顯色：每孔加入底物A液50µl再加入底物B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境避光顯色15min。
• 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定吸光度值（OD值）。

七、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含喹諾酮類藥物量成負相關(guān)。

1、粗略判定：

    用樣本的平均吸光度值與標準品比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.238， 樣本2的吸光度值為0.946，標準液吸光度值分別是：0ppb為1.845； 0.1ppb為1.542；0.3ppb為1.130； 0.9ppb為0.635；2.7ppb為0.326； 8.1ppb為0.156。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb - 8.1ppb；樣本2的濃度范圍是0.3ppb - 0.9ppb。乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中喹諾酮類藥物的實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第--個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪制與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，以喹諾酮類標準品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中喹諾酮類藥物實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。

八、 注意事項

• 室溫低于25℃或試劑及標本未回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標準的OD值偏低。
• 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標準曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。
• 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
• 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
• 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
• 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
• 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當棄之。標準品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質(zhì)。
• 該試劑盒*佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲藏條件和保質(zhì)期

• 儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。
• 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。

提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結(jié)果，請放心使用。

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